ข้อดีพิเศษของ ELISA ที่มีความไวสูงพิเศษพร้อม Thio-NAD Cycling ในการตรวจวัดโปรตีน NS1 ของโรคไข้เลือดออก
1. บทนำ
ไข้เลือดออกเป็นโรคติดเชื้อเฉียบพลันที่เกิดจากไวรัสเดงกี ผ่านการถูกยุงลาย (Ae. aegypti หรือ Ae. albopictus) ที่ติดเชื้อกัดโดยมีอาการหลัก เช่น ไข้สูง เวียนศีรษะ ปวดศีรษะ ผื่น และรุนแรง ปวด (ปวดตา ปวดกล้ามเนื้อ ปวดข้อ หรือปวดกระดูก) เป็นต้น โรคนี้แพร่ระบาดอย่างกว้างขวางในภูมิอากาศเขตร้อนและกึ่งเขตร้อน คาดว่ามีผู้ติดเชื้อประมาณ 100 ถึง 400 ล้านคนต่อปี โดยกว่า 80% มักมีอาการไม่รุนแรงและไม่มีอาการ อย่างไรก็ตาม ไข้เลือดออกรุนแรงอาจเพิ่มความเสี่ยงต่อการเสียชีวิตหากไม่ได้รับการรักษาอย่างเหมาะสม ดังนั้น การวินิจฉัยโรคนี้ตั้งแต่เนิ่นๆ จึงมีความสำคัญต่อการรักษาอย่างทันท่วงทีที่น่าสังเกตคือ โปรตีน non-structural protein 1 (NS1) ซึ่งเป็นไกลโคโปรตีนที่อนุรักษ์สูง ถูกหลั่งออกมาเป็นหลักในระหว่างการติดเชื้อไวรัสเดงกี ซึ่งถูกพิจารณาอย่างเข้มข้นว่าเป็นปัจจัยหลักในการก่อโรคของไข้เลือดออก ดังนั้น NS1 จึงถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพโดยทั่วไปสำหรับการตรวจหาโรคนี้ในระยะเริ่มแรกในการศึกษานี้ ใช้วิธี sandwich enzyme-linked immunosorbent assay
ในการศึกษานี้ การทดสอบเอนไซม์ลิงก์อิมมูโนซอร์เบนท์แบบแซนด์วิช (ELISA) ร่วมกับวิธีthio nicotinamide adenine dinucleotide (thio-NAD/S-NAD)cycling (ซึ่งต่อไปนี้เรียกว่า อัลตราไวส์ ELISA) เพื่อตรวจหา NS1 จากนั้นเปรียบเทียบกับ NAAT เพื่อยืนยันความแม่นยำในการตรวจ
2. ข้อดีและข้อเสียของวิธีการตรวจแบบดั้งเดิมสำหรับ ดังนั้น NS1 จึงถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพโดยทั่วไปสำหรับการตรวจหาโรคนี้ในระยะเริ่มแรก
ในปัจจุบันมีวิธีการตรวจหลักสี่วิธี ลบ ไข้เลือดออก
การแยกไวรัส และการระบุชนิดมีความจำเพาะสูงแต่ใช้เวลานาน อย่างน้อย 5 วัน การตรวจหาแอนติเจนอย่างรวดเร็ว เป็นวิธีที่เร็วที่สุดและคุ้มค่าที่สุดเมื่อเทียบกับวิธีอื่นๆ แต่ความไว และความจำเพาะค่อนข้างต่ำ การตรวจทางซีรัมวิทยาโดยอาศัย IgM และ IgG มีข้อจำกัดจาก จำนวนวันของการติดเชื้อ เนื่องจากผู้การตรวจต้องเลื่อนออกไปจนกว่าระดับแอนติบอดี จะสูงขึ้นถึงระดับที่ตรวจพบได้
ในทางคลินิก มักใช้ NAAT เพื่อตรวจหา ดังนั้น NS1 จึงถูกใช้เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพโดยทั่วไปสำหรับการตรวจหาโรคนี้ในระยะเริ่มแรก เนื่องจากมีความไวและความจำเพาะสูง อย่างไรก็ตาม วิธีนี้มีราคาแพง ใช้แรงงานมาก และมีแนวโน้มที่จะให้ผลบวกลวง ซึ่งต้องดำเนินการโดยบุคลากรที่ผ่านการฝึกอบรมเพื่อเอาชนะข้อเสียของวิธีการเหล่านี้ จึงได้นำวิธีการตรวจใหม่อัลตราไวส์ ELISA มาใช้ในการศึกษานี้
3. ขั้นตอนการทำงานของอัลตราไวส์ ELISA ร่วมกับ Thio-NAD cycling
แอนติบอดีคู่หนึ่ง是ใช้สำหรับจับโปรตีน NS1 ใน sandwich ELISA และ alkaline phosphatase是ติดฉลากบนแอนติบอดีทุติยภูมิ นอกเหนือจากแอนติบอดีแล้ว อนุพันธ์ของแอนโดรสเตอโรน 3α-hydroxysteroid dehydrogenase, thio-NAD และ NADHถูกใช้เพื่อสร้างระบบ thio-NAD enzyme cycling ในระหว่างปฏิกิริยา thio-NAD cycling นั้น thio-NADH จะสะสมอย่างต่อเนื่องในลักษณะเลขสามเหลี่ยม และสามารถวัดได้โดยตรงที่ค่าการดูดกลืนแสง 405 นาโนเมตร.
4. การเปรียบเทียบอัลตราไวส์ ELISA และ NAAT ในการตรวจหาโปรตีน NS1 ของไวรัสเดงกี
ใน NAAT ตัวอย่าง 60 รายการเป็นบวกต่อไวรัสเดงกี และ 25 รายการเป็นลบ ค่า cycling threshold (CT) ของ NAAT สำหรับตัวอย่างที่เป็นบวกเหล่านั้นอยู่ในช่วง 12.42 ถึง 31.41ในอัลตราไวส์ ELISA ตัวอย่าง 59 รายการให้ผลบวกสอดคล้องกับผล NAAT ในขณะที่ตัวอย่าง 25 รายการให้ผลลบสอดคล้องกับผล NAAT อย่างสมบูรณ์เมื่อเปรียบเทียบกับ NAAT ความไวและความจำเพาะของอัลตราไวส์ ELISA คือ 98.3% และ 100% ตามลำดับ (ตารางที่ 2) จากตัวอย่างผู้ป่วยที่ยืนยันว่าเป็นไข้เลือดออกด้วย NAAT จำนวน 60 รายการ มีเพียง 1 รายการที่ให้ผลลบในอัลตราไวส์ ELISA ข้อมูล NAAT แสดงให้เห็นว่าตัวอย่างดังกล่าวเป็นการติดเชื้อ DENV ชนิดที่ 4 โดยมีค่า CT เท่ากับ 21.59 ผลของอัลตราไวส์ ELISA สอดคล้องกับผล NAAT เกือบสมบูรณ์ โดยมีค่า kappa เท่ากับ 0.972 (95% CI: 0.917-1.0).
5. บทสรุป
ในระดับอัลตราวิธีอัลตราไวส์ ELISA นั้นง่ายต่อการดำเนินการและไม่ต้องใช้ผู้เชี่ยวชาญที่ผ่านการฝึกอบรม การตรวจสามารถเริ่มได้ทันทีหลังจากได้รับตัวอย่างขนาดเล็ก เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจหาโรคในระยะเริ่มแรกในประเทศที่มีรายได้น้อยไวรัสเดงกีโรคในประเทศที่มีรายได้ต่ำ.เอกสารอ้างอิง
Chen, Po-Kai et al. “Advanced Detection Method for Dengue NS1 Protein Using Ultrasensitive ELISA with Thio-NAD Cycling.” Viruses vol. 15,9 1894. 8 Sep. 2023, doi:10.3390/v15091894ข้อดีและคุณสมบัติของผลิตภัณฑ์BONTAC Thio-NAD/S-NAD
BONTAC เป็นหนึ่งในไม่กี่บริษัทในจีนที่สามารถผลิต Thio-NAD ด้วย“Bonzyme” วิธีเอนไซม์ทั้งหมด (เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อม;ไม่มีสารตกค้างจากตัวทำละลายที่เป็นอันตราย) และ เทคโนโลยีการทำให้บริสุทธิ์เจ็ดขั้นตอนเฉพาะ “Bonpure” ที่ไม่เหมือนใคร BONTAC บูรณาการการวิจัยและพัฒนา การผลิต และการขาย โดยมี โรงงานของตนเองและการรับรองระดับนานาชาติหลายรายการเพื่อให้มั่นใจในคุณภาพสูงและการจัดหาผลิตภัณฑ์ที่มั่นคง.
