การปรับสภาวะปฏิกิริยาเพื่อให้ได้ผลผลิตสูงของสตีเวีย Rebaudioside D
การบริโภคอาหารที่มีน้ำตาลสูงส่งผลให้ความชุกของโรคเรื้อรังต่างๆ เพิ่มขึ้น เช่น โรคอ้วน เบาหวาน โรคหัวใจและหลอดเลือด และความดันโลหิตสูง ซึ่งเป็นปัญหาสาธารณสุขระดับโลกที่สำคัญ Stevia Rebaudioside D (Reb D) ซึ่งเป็นสารให้ความหวานธรรมชาติที่สกัดจากพืช ได้รับความสนใจอย่างมากในฐานะสารทดแทนน้ำตาล เนื่องจากมีแคลอรีเป็นศูนย์ ความหวานเข้มข้น และรสชาติที่น่าพึงพอใจ
อย่างไรก็ตาม การมีอยู่จำกัดในหญ้าหวาน (Stevia rebaudiana Bertoni) และความท้าทายที่เกี่ยวข้องกับความสามารถในการละลายต่ำและกิจกรรมของเอนไซม์ไกลโคซิลทรานสเฟอเรสที่ได้จากพืช ได้เป็นอุปสรรคต่อการนำไปใช้ในเชิงพาณิชย์อย่างแพร่หลาย เพื่อตอบสนองต่อปัญหาเหล่านี้ จึงได้ค้นพบไกลโคซิลทรานสเฟอเรสชนิดใหม่ที่เรียกว่า YojK ซึ่งมีต้นกำเนิดจาก Bacillus subtilis 168 การศึกษานี้แนะนำไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากแบคทีเรียที่ผ่านการดัดแปลงพันธุกรรมชื่อ YojK-I241T/G327N ซึ่งมีคุณสมบัติเด่นคือความสามารถในการละลายสูงและประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยาสูง มีศักยภาพอย่างมากสำหรับการผลิต Reb D ในระดับอุตสาหกรรม
การพัฒนาวิธีการที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับการผลิต rebaudioside D โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่ของเอนไซม์ YojK-I241T/G327N และ AtSuSy
เพื่อแก้ไขปัญหาความสามารถในการละลายต่ำของไกลโคซิลทรานสเฟอเรสที่ได้จากพืช นักวิจัยได้ศึกษาศักยภาพของการใช้ YojK ซึ่งเป็น O-ไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจาก Bacillus subtilis 168 เลือกใช้ YojK เนื่องจากแสดงกิจกรรมไกลโคซิเลชันกับสารตั้งต้นต่างๆ รวมถึงโมเลกุลขนาดใหญ่ หลังจากการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์แบบรีคอมบิแนนท์ที่ประสบความสำเร็จ YojK ถูกนำมาใช้เพื่อไกลโคซิเลต Reb A ส่งผลให้เกิดการผลิต Stevia Reb D การวิเคราะห์จลนศาสตร์ของเอนไซม์เผยให้เห็นว่า YojK มีกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาต่อ Reb D ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับไกลโคซิลทรานสเฟอเรสอื่นๆ ดังนั้น การศึกษาจึงแนะนำความจำเป็นในการวิศวกรรมเชิงโครงสร้างเพื่อเพิ่มกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของ YojK สำหรับการประยุกต์ใช้ในทางปฏิบัติที่มีศักยภาพ (ดังแสดงในรูปที่ 1)
รูปที่ 1
การปรับสภาวะปฏิกิริยาเพื่อให้ได้ผลผลิต rebaudioside D สูง
สภาวะปฏิกิริยา รวมถึง pH อุณหภูมิ และความเข้มข้นของสารตั้งต้น สามารถปรับให้เหมาะสมเพื่อให้ได้ผลผลิต Srevia Reb D สูง การศึกษาใช้การจำลองพลศาสตร์โมเลกุลเพื่อตรวจสอบว่าตัวแปร YojK-I241T/G327N ช่วยเพิ่มไกลโคซิเลชันของ Reb D ได้อย่างไร ตัวแปรนี้รักษาพันธะไฮโดรเจนที่เสถียรระหว่าง Reb A และ H14 ในระหว่างการจำลอง ต่างจากชนิดไวลด์ไทป์ (ดังแสดงในรูปที่ 2) ความเสถียรนี้ยังขยายไปถึงระยะห่างระหว่างอะตอม O2 ของ Reb A และ C1P ของ UDPG ประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยาที่ดีขึ้นของตัวแปร YojK-I241T/G327N เกิดจากปฏิกิริยาที่เสถียรเหล่านี้ ซึ่งบ่งชี้ถึงศักยภาพในทางปฏิบัติ
รูปที่ 2
รูปที่ 3
บทสรุป
วิธีการนี้ให้ผลผลิต Reb D 83.47% ที่น่าสนใจคือ การเติม UDPG 1 mM ทำให้สามารถสังเคราะห์ Reb D ได้ 20.59 กรัม/ลิตร ด้วยผลผลิตที่น่าทึ่งถึง 91.29% ซึ่งเหนือกว่าการศึกษาก่อนหน้านี้ กระบวนการนี้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพสำหรับการผลิต Reb D ในระดับอุตสาหกรรม โดยเฉพาะหลังจากการวิศวกรรมเชิงโครงสร้างของ YojKYojK สามารถแสดงออกได้อย่างมีประสิทธิภาพใน E. coli BL21 (DE3) ด้วยความสามารถในการละลายสูง ผ่านการวิศวกรรมเชิงโครงสร้าง ได้สร้างตัวกลายพันธุ์คู่ YojK-I241T/G327N ซึ่งทำให้สามารถผลิต Reb D ในปริมาณมากด้วยผลผลิตที่ยอดเยี่ยมถึง 91.29% โดยการรีไซเคิล UDPG ที่เร่งปฏิกิริยาโดยซูโครสซินเทส AtSuSy การศึกษานี้นำเสนอ YojK-I241T/G327N เป็นเครื่องมือที่มีแนวโน้มสำหรับการผลิต Reb D ในระดับอุตสาหกรรมที่คุ้มค่าทางเศรษฐกิจ
