วิศวกรรมเอนไซม์แบบ coupled กับการเจริญเติบโตผ่านการจัดการการสร้างโคแฟกเตอร์รีดอกซ์ใหม่

สารเคมีหลากหลายชนิดมากขึ้นเรื่อยๆ กำลังถูกผลิตจากวัตถุดิบหมุนเวียนผ่านวิธีการทางเทคโนโลยีชีวภาพ กระบวนการทางชีวภาพพึ่งพาการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์อย่างมากเพื่อการผลิตสารประกอบเหล่านี้อย่างมีประสิทธิภาพ การทำให้เอนไซม์ทำงานได้อย่างเหมาะสมที่สุดในสภาพแวดล้อมที่ต้องการจึงเป็นสิ่งที่น่าสนใจอย่างมากสำหรับการผลิตที่ยั่งยืน

คุณสมบัติเช่น ความจำเพาะต่อซับสเตรต อัตราการเร่งปฏิกิริยา และความเสถียร (ต่อความร้อน) เป็นปัจจัยสำคัญหลายประการที่ต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับกระบวนการทางชีวภาพที่ขับเคลื่อนด้วยเอนไซม์อย่างมีประสิทธิภาพ การปรับให้เหมาะสมนี้อาจใช้เวลานาน มีค่าใช้จ่ายสูง และท้าทาย ดังนั้นวิธีการที่มีประสิทธิภาพและคุ้มค่าสำหรับการคัดเลือกแบบ coupled กับการเจริญเติบโต การวิศวกรรมเอนไซม์ที่มีคุณลักษณะที่พึงประสงค์จึงเป็นที่ต้องการอย่างมาก

ข้อดีของการใช้การคัดเลือกแบบ coupled กับการเจริญเติบโตเป็นรูปแบบหนึ่งของการคัดเลือกเอนไซม์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเชื่อมโยงกิจกรรมของเอนไซม์เข้ากับการเจริญเติบโตของเซลล์ วิธีนี้สามารถใช้เป็นกลยุทธ์การคัดเลือกที่มีปริมาณงานสูง และสามารถทำได้โดยการทำให้การเจริญเติบโตขึ้นอยู่กับการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์โดยเอนไซม์เป้าหมาย หรือโดยการเชื่อมโยงกิจกรรมของเอนไซม์เข้ากับสถานะพลังงานโดยรวมของเซลล์ ชีววิทยาสังเคราะห์สามารถใช้ในการวิศวกรรมสายพันธุ์ที่เหมาะสมสำหรับการคัดเลือกแบบ coupled กับการเจริญเติบโต และความก้าวหน้าล่าสุดได้มุ่งเน้นไปที่การวิศวกรรมสายพันธุ์ที่ขาดสถานะออกซิไดซ์หรือรีดิวซ์ของคู่โคแฟกเตอร์รีดอกซ์ ซึ่งสามารถใช้เป็นแพลตฟอร์มวิศวกรรมเอนไซม์ การใช้แพลตฟอร์มเหล่านี้อาจเร่งการพัฒนาตัวเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพและกระบวนการทางชีวภาพที่ดียิ่งขึ้น

ประโยชน์ของการ coupled การเจริญเติบโตผ่านการขาดโคแฟกเตอร์

ประโยชน์ของการใช้การขาดโคแฟกเตอร์เป็นวิธีการคัดเลือกสำหรับการวิศวกรรมเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของสารเคมีบางชนิด เช่น ลิปิด เชื้อเพลิงชีวภาพ ก๊าซ ตัวทำละลายอินทรีย์ หรือสารประกอบโพลีเมอร์ วิธีการนี้มีข้อดีเฉพาะหลายประการ รวมถึงความสามารถในการคัดเลือกผลิตภัณฑ์ที่ต้องการโดยไม่ขึ้นกับซับสเตรตหรือผลิตภัณฑ์ที่สนใจ ทำให้ง่ายต่อการตรวจจับกิจกรรมของเอนไซม์ที่ดีขึ้น และให้การอ่านค่าสำหรับการตรวจจับกิจกรรมของเอนไซม์ที่ดีขึ้น นอกจากนี้ การใช้เซลล์ที่ขาดโคแฟกเตอร์เป็นแพลตฟอร์มการ coupled การเจริญเติบโตยังมีประโยชน์เนื่องจากธรรมชาติที่แพร่หลายของโคแฟกเตอร์รีดอกซ์ในเมแทบอลิซึมของจุลินทรีย์หมายความว่ากลยุทธ์ทางวิศวกรรมสามารถถ่ายโอนไปยังจุลินทรีย์อื่นๆ ที่สนใจได้ และเอนไซม์สามารถถูกวิศวกรรมได้โดยตรงภายในสภาพแวดล้อมของโฮสต์จุลินทรีย์ที่ต้องการ (แสดงในรูปที่ 1)

รูปที่ 1: การเปรียบเทียบเทคนิคการคัดกรอง/การคัดเลือกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายหลายวิธีสำหรับวิศวกรรมเอนไซม์

กลายพันธุ์ที่ขาดการออกซิเดชันของ NADH

การออกซิเดชันของ NADH ใน E. coli สามารถเกิดขึ้นได้สองเส้นทาง ขึ้นอยู่กับความพร้อมของออกซิเจน ภายใต้สภาวะแอโรบิก NADH ถูกออกซิไดซ์主要通过การหายใจเพื่อสร้าง ATP ในขณะที่ภายใต้สภาวะแอนแอโรบิก สามารถถูกออกซิไดซ์ผ่านเส้นทางการหมักเพื่อผลิตแลคเตตและเอทานอล สายพันธุ์กลายพันธุ์ของ E. coli ที่ไม่สามารถใช้เส้นทางการหมักแบบผสมสำหรับการออกซิเดชันของ NADH ในระหว่างการเจริญเติบโตแบบแอนแอโรบิก ถูกใช้เพื่อขับเคลื่อนเส้นทางการออกซิไดซ์ NADH สำหรับการสังเคราะห์สารเคมีต่างๆ แบบแอนแอโรบิก เช่น 2-เมทิลโพรพาน-1-ออล 2,3-บิวเทนไดออล 1-บิวทานอล และ L-อะลานีน สายพันธุ์กลายพันธุ์เหล่านี้ยังถูกใช้เพื่อวิศวกรรมเอนไซม์โดยใช้หลักการรีดอกซ์ที่คล้ายคลึงกัน ส่งผลให้ได้สายพันธุ์ที่ดีขึ้น สายพันธุ์ที่ได้สามารถใช้เพื่อวิศวกรรมเอนไซม์และเส้นทางที่ขึ้นกับ NAD(P)H อื่นๆ

กลายพันธุ์ที่ขาดการรีดักชันของ NAD+

Wenk และคณะสร้างสายพันธุ์ E. coli โดยการลบยีน dihydrolipoyl dehydrogenase (lpd) ซึ่งส่งผลให้สายพันธุ์ไม่สามารถสร้างพลังงานรีดิวซ์ (NADH และ NADPH) จากเมแทบอลิซึมของอะซิเตตเนื่องจากการไม่มีกิจกรรมของ pyruvate dehydrogenase สิ่งนี้ทำให้สายพันธุ์แสดงการขาดพลังงานรีดิวซ์เมื่อเติบโตแบบแอโรบิกโดยใช้อะซิเตตเป็นแหล่งคาร์บอนเพียงแหล่งเดียว (แสดงในรูปที่ 2) สายพันธุ์สามารถเติบโตบนอะซิเตตเมื่อเสริมด้วยซับสเตรตไกลโคไลติกตอนบนหรือเมื่อแสดงออก NAD+-dependent formate-, ethanol- หรือ methanol dehydrogenases กับซับสเตรตตามลำดับ สายพันธุ์ไม่ได้ถูกใช้สำหรับวิศวกรรมเอนไซม์และถูกประเมินเฉพาะการขาดโคแฟกเตอร์รีดอกซ์

รูปที่ 2: เมแทบอลิซึมส่วนกลาง

กลายพันธุ์ที่ขาดการออกซิเดชันของ NADPH

มีสองกลยุทธ์ที่แตกต่างกันสำหรับการเหนี่ยวนำการขาด NADP+ ใน E. coli โดยอาศัยการวิศวกรรมเส้นทางไกลโคไลซิสเพื่อผลิต NADPH มากเกินไป กลยุทธ์แรกเกี่ยวข้องกับการลบยีน gapA ดั้งเดิมและการแสดงออกของเอนไซม์ GAPDH ที่ขึ้นกับ NADP+ จากต่างชนิดกัน ในขณะที่กลยุทธ์ที่สองเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนเส้นทางการไหลของคาร์บอนผ่านเส้นทางเพนโทสฟอสเฟต สายพันธุ์ที่ได้ไม่สามารถเติบโตบนกลูโคสแต่แสดงการเจริญเติบโตในสภาวะที่แตกต่างกัน โดยสายพันธุ์แรกเติบโตภายใต้สภาวะแอนแอโรบิกและสายพันธุ์ที่สองภายใต้สภาวะแอโรบิกโดยมีกลีเซอรอลเป็นซับสเตรต สายพันธุ์เหล่านี้ถูกใช้สำหรับการวิศวกรรมเอนไซม์ที่มีคุณสมบัติที่ดีขึ้น รวมถึงความจำเพาะต่อซับสเตรต กิจกรรมเร่งปฏิกิริยา และความเสถียรต่อความร้อน

กลายพันธุ์ที่ขาดการรีดักชันของ NADP+

แบคทีเรียสามชนิดที่แตกต่างกัน ได้แก่ E. coli, P. putida และ C. glutamicum ถูกวิศวกรรมให้เป็น NADPH-auxotrophic หมายความว่าพวกมันต้องการ NADPH จากภายนอกสำหรับการเจริญเติบโต ในกรณีของ E. coli และ C. glutamicum เอนไซม์เมแทบอลิซึมส่วนกลางถูกน็อกเอาต์เพื่อหลีกเลี่ยงการรีดักชันของ NADP+ เมื่อให้กลูโคสเป็นแหล่งคาร์บอน ในขณะที่ใน P. putida ใช้วิศวกรรมที่ช่วยด้วย CRISPR/nCas9 เพื่อขัดขวางชุดของยีนเป้าหมายตามลำดับเพื่อทำความเข้าใจการมีส่วนร่วมในเมแทบอลิซึมรีดอกซ์ สายพันธุ์ NADPH-auxotrophic ถูกใช้สำหรับวิศวกรรมเอนไซม์แบบ coupled กับการเจริญเติบโตโดยอิงตามความจำเพาะของโคแฟกเตอร์ การกลายพันธุ์หนึ่งรอบโดยใช้ E. coli ให้ผลผลิต formate dehydrogenase ที่ขึ้นกับ NADP+ ที่มีประสิทธิภาพและจำเพาะที่สุดจนถึงปัจจุบัน ในขณะที่ P. putida และ C. glutamicum เป็นตัวแทนของสายพันธุ์แรกของชนิดของพวกมันที่สามารถใช้สำหรับการวิศวกรรมประเภทนี้

กลายพันธุ์ที่ขาดการรีดักชันของ NMN+

ได้มีการพัฒนาระบบการคัดเลือกแบบ growth-coupled เพื่อเชื่อมโยงการหมุนเวียนของโคแฟกเตอร์และการเจริญเติบโต โดยอาศัยการขาดการรีดิวซ์ของ NMN+ ใช้สายพันธุ์ E. coli SHuffle ซึ่งมีการตัดยีนสองยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิตกลูตาไธโอนรีดิวซ์ ได้มีการพัฒนากลูตาไธโอนรีดักเทสที่ขึ้นกับ NMNH ผ่านการกลายพันธุ์แบบมีเหตุผลเพื่อเชื่อมโยงกระบวนการเข้ากับการหมุนเวียน NMN+/NMNH และใช้ NMN+-dependent glucose dehydrogenase เพื่อสนับสนุนการหมุนเวียนโคแฟกเตอร์ NMN+/NMNH และด้วยเหตุนี้จึงสนับสนุนการเจริญเติบโต การศึกษายังได้ประยุกต์ใช้ non-canonical redox cofactor auxotrophy สำหรับวิศวกรรมเอนไซม์แบบ growth-coupled เป็นครั้งแรก ส่งผลให้ได้ฟอสไฟต์ดีไฮโดรจีเนสที่ทนความร้อนซึ่งมีประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยาและความเสถียรเชิงเวลาที่ดีขึ้นในหลอดทดลอง งานนี้ให้สายพันธุ์ที่มีประโยชน์สำหรับวิศวกรรมเอนไซม์แบบ growth-coupled ซึ่งขึ้นอยู่กับการหมุนเวียน NMN+/NMNH และเป็น auxotrophic สำหรับสถานะรีดิวซ์ของโคแฟกเตอร์รีดอกซ์ที่ไม่เป็นมาตรฐาน

ศักยภาพของการเชื่อมโยงการเจริญเติบโตผ่านโคแฟกเตอร์รีดอกซ์เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการออกแบบตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพ โดยเฉพาะในบริบทของการผลิตชีวภาพที่ยั่งยืน แม้ว่าจะมีความก้าวหน้าอย่างมากในการสร้างสายพันธุ์ที่ขาดโคแฟกเตอร์รีดอกซ์ แต่ข้อความดังกล่าวชี้ให้เห็นว่ายังมีแนวทางการวิจัยอีกหลายด้านที่ยังไม่ได้สำรวจ หนึ่งในนั้นคือการวิศวกรรมสายพันธุ์ที่ขาดโคแฟกเตอร์ในสิ่งมีชีวิตอื่นนอกเหนือจาก E. coli ซึ่งอาจเปิดโอกาสใหม่สำหรับวิศวกรรมเอนไซม์แบบ growth-coupled

โดยรวมแล้ว ข้อความชี้ให้เห็นว่าการใช้การเชื่อมโยงการเจริญเติบโตโดยอาศัยโคแฟกเตอร์รีดอกซ์เป็นโอกาสสำคัญสำหรับการวิศวกรรมตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพ โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ไม่สามารถตอบสนองข้อกำหนดของวิธีการวิศวกรรมเอนไซม์ที่มีปริมาณงานสูงอื่นๆ ได้ ข้อความเน้นย้ำถึงความจำเป็นในการพัฒนาตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพที่มีความหลากหลายและมีประสิทธิภาพมากขึ้นสำหรับการผลิตชีวภาพที่ยั่งยืน และเน้นย้ำถึงความสำคัญของการวิจัยอย่างต่อเนื่องในด้านนี้


เอกสารอ้างอิง: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.