วิศวกรรมเอนไซม์ที่เชื่อมโยงการเจริญเติบโตผ่านการจัดการการฟื้นฟูโคแฟกเตอร์รีดอกซ์

ปัจจุบันมีการผลิตสารเคมีจากวัตถุดิบหมุนเวียนผ่านเทคโนโลยีชีวภาพมากขึ้นเรื่อย ๆ กระบวนการทางชีวภาพพึ่งพาการเร่งปฏิกิริยาด้วยเอนไซม์อย่างมากเพื่อการผลิตสารเหล่านี้อย่างมีประสิทธิภาพ การรับรองว่าเอนไซม์ทํางานได้อย่างเหมาะสมในสภาพแวดล้อมที่ต้องการจึงเป็นเรื่องที่มีความสําคัญอย่างยิ่งสําหรับการผลิตที่ยั่งยืน

คุณสมบัติต่าง ๆ เช่น ความจําเพาะของสารตั้งต้น อัตราการเร่งปฏิกิริยา และความเสถียรทางความร้อน เป็นปัจจัยสําคัญหลายประการที่ต้องได้รับการปรับแต่งเพื่อให้กระบวนการชีวภาพที่ขับเคลื่อนด้วยเอนไซม์มีประสิทธิภาพ การปรับแต่งนี้อาจใช้เวลานาน มีค่าใช้จ่ายสูง และท้าทาย ดังนั้นจึงเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพและคุ้มค่าสําหรับการคัดเลือกที่เชื่อมโยงกับการเจริญเติบโต เอนไซม์วิศวกรรมที่มีลักษณะที่ต้องการจึงเป็นที่ต้องการอย่างมาก

ข้อดีของการใช้การคัดเลือกแบบผูกพันกับการเจริญเติบโตเป็นรูปแบบหนึ่งของการคัดเลือกเอนไซม์ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเชื่อมโยงกิจกรรมของเอนไซม์กับการเจริญเติบโตของเซลล์ วิธีนี้สามารถใช้เป็นกลยุทธ์การคัดเลือกแบบปริมาณงานสูง และสามารถทําได้โดยการรับรองว่าการเจริญเติบโตขึ้นอยู่กับการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ของเอนไซม์เป้าหมาย หรือโดยการเชื่อมโยงกิจกรรมของเอนไซม์กับสถานะพลังงานโดยรวมของเซลล์ ชีววิทยาสังเคราะห์สามารถใช้ในการวิศวกรรมสายพันธุ์ที่เหมาะสมสําหรับการคัดเลือกแบบผสมการเจริญเติบโต และความก้าวหน้าล่าสุดมุ่งเน้นไปที่การวิศวกรรมสายพันธุ์ที่ขาดสถานะออกซิไดซ์หรือสถานะลดของคู่โคแฟกเตอร์รีดอกซ์ ซึ่งสามารถใช้เป็นแพลตฟอร์มวิศวกรรมเอนไซม์ได้ การใช้แพลตฟอร์มเหล่านี้อาจเร่งการพัฒนาตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพและกระบวนการชีวภาพที่ดีขึ้น

ประโยชน์ของการจับคู่การเจริญเติบโตผ่านการเสริมสร้างโคแฟกเตอร์

ประโยชน์ของการใช้โคแฟกเตอร์ออกโซโทรฟีเป็นวิธีการคัดเลือกเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์สารเคมีบางชนิด เช่น ไขมัน เชื้อเพลิงชีวภาพ ก๊าซ ตัวทําละลายอินทรีย์ หรือสารประกอบโพลิเมอร์ แนวทางนี้มีข้อดีหลายประการ รวมถึงความสามารถในการเลือกผลิตภัณฑ์ที่ต้องการโดยไม่ขึ้นกับสารตั้งต้นหรือผลิตภัณฑ์ที่สนใจ ทําให้ตรวจจับกิจกรรมเอนไซม์ที่ดีขึ้นได้ง่ายขึ้น และมีการแสดงผลเพื่อตรวจพบกิจกรรมของเอนไซม์ที่ดีขึ้น นอกจากนี้ การใช้โคแฟกเตอร์ออกโซโทรฟเป็นแพลตฟอร์มการจับคู่การเจริญเติบโตยังมีประโยชน์ เพราะโคแฟกเตอร์รีดอกซ์ที่พบได้ทั่วไปในกระบวนการเผาผลาญของจุลินทรีย์หมายความว่ากลยุทธ์ทางวิศวกรรมสามารถถ่ายโอนไปยังจุลินทรีย์อื่นที่สนใจในแนวข้าง และเอนไซม์สามารถถูกออกแบบโดยตรงภายในสภาพแวดล้อมของโฮสต์จุลินทรีย์ที่ต้องการ (แสดงในรูปที่ 1)

รูปที่ 1: การเปรียบเทียบเทคนิคการคัดกรอง/คัดเลือกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายหลายสําหรับวิศวกรรมเอนไซม์

มิวแทนต์ที่ขาดการออกซิเดชัน NADH

การออกซิเดชันของ NADH ใน E. coli สามารถเกิดขึ้นได้สองเส้นทาง ขึ้นอยู่กับปริมาณออกซิเจนที่มีอยู่ ภายใต้สภาวะออกซิเจน NADH จะถูกออกซิไดซ์เป็นหลักผ่านการหายใจเพื่อสร้าง ATP ขณะที่ในสภาวะไม่ใช้ออกซิเจน สามารถถูกออกซิไดซ์ผ่านกระบวนการหมักเพื่อสร้างแลคเตตและเอทานอล สายพันธุ์กลายพันธุ์ของ E. coli ซึ่งไม่สามารถใช้เส้นทางการหมักผสมสําหรับการออกซิเดชัน NADH ในระหว่างการเจริญเติบโตแบบไม่ใช้ออกซิเจน ได้ถูกนํามาใช้เพื่อขับเคลื่อนเส้นทางออกซิไดซ์ NADH สําหรับการสังเคราะห์สารเคมีต่าง ๆ แบบไม่ใช้ออกซิเจน เช่น 2-methylpropan-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol และ L-alanine สายพันธุ์กลายพันธุ์เหล่านี้ยังถูกนํามาใช้ในการออกแบบเอนไซม์โดยใช้หลักการรีดอกซ์ที่คล้ายกัน ส่งผลให้เกิดสายพันธุ์ที่ปรับปรุงขึ้น สายพันธุ์ที่ได้สามารถนําไปใช้ดัดแปลงเอนไซม์และเส้นทางที่ขึ้นกับ NAD(P)H อื่น ๆ ได้

กลายพันธุ์ที่ขาดการลด NAD+  

Wenk และคณะสร้างสายพันธุ์ E. coli โดยการลบยีน dihydrolipoyl dehydrogenase (lpd) ซึ่งทําให้สายพันธุ์นี้ไม่สามารถสร้างพลังงานรีดิวซ์ (NADH และ NADPH) จากการเผาผลาญอะซิเตตได้เนื่องจากไม่มีกิจกรรมของไพรูเวตดีไฮโดรจีเนส สิ่งนี้ทําให้สายพันธุ์แสดงออกถึงการลดกําลังเมื่อปลูกแบบแอโรบิกบนอะซิเตตเป็นแหล่งคาร์บอนเพียงอย่างเดียว (แสดงในรูปที่ 2) สายพันธุ์นี้สามารถเติบโตบนอะซิเตตเมื่อเสริมด้วยสารตั้งต้นไกลโคไลติกบนหรือเมื่อแสดงออกสารดีไฮโดรเจนเอสที่ขึ้นกับ NAD+, เอทานอล หรือเมทานอล กับสารตั้งต้นที่เกี่ยวข้อง สายพันธุ์นี้ไม่ได้ถูกใช้ในวิศวกรรมเอนไซม์ และได้รับการประเมินเฉพาะการออกซิกซ์โคแฟกเตอร์ auxotrophy เท่านั้น
 

รูปที่ 2: เมตาบอลิซึมส่วนกลาง 

มิวแทนต์ที่ขาดการออกซิเดชัน NADPH

มีสองกลยุทธ์ที่แตกต่างกันในการกระตุ้น NADP+ auxotrophy ใน E. coli โดยอาศัยการออกแบบเส้นทางไกลโคไลติกเพื่อผลิต NADPH เกิน กลยุทธ์แรกคือการลบยีน gapA ดั้งเดิมและแสดงออกเอนไซม์ GADH ที่ขึ้นกับ NADP+ แบบไม่ปกติ ขณะที่กลยุทธ์ที่สองคือการเปลี่ยนทิศทางการไหลของคาร์บอนผ่านเส้นทางเพนโทสฟอสเฟต สายพันธุ์ที่ได้ไม่สามารถเจริญเติบโตบนกลูโคสได้ แต่จะเจริญเติบโตในสภาวะที่แตกต่างกัน โดยสายพันธุ์แรกเติบโตภายใต้สภาวะไม่ใช้ออกซิเจน และสายพันธุ์ที่สองเติบโตภายใต้สภาวะออกซิเจนโดยใช้กลีเซอรอลเป็นสารตั้งต้น สายพันธุ์เหล่านี้ใช้ในการวิศวกรรมเอนไซม์ที่มีคุณสมบัติดีขึ้น รวมถึงความจําเพาะของสารตั้งต้น กิจกรรมเร่งปฏิกิริยา และความเสถียรทางความร้อน

กลายพันธุ์ที่ขาดการลด NADP+

แบคทีเรียสามชนิด ได้แก่ E. coli, P. putida และ C. glutamicum ถูกออกแบบให้เป็น NADPH-auxotrophic หมายความว่าพวกมันต้องการ NADPH จากภายนอกเพื่อการเจริญเติบโต ในกรณีของ E. coli และ C. glutamicum เอนไซม์เมตาบอลิซึมส่วนกลางถูกตัดออกเพื่อหลีกเลี่ยงการลด NADP+ เมื่อกลูโคสถูกให้เป็นแหล่งคาร์บอน ขณะที่ใน P. putida ใช้วิศวกรรม CRISPR/nCas9 เพื่อรบกวนชุดยีนเป้าหมายทีละชุดเพื่อเข้าใจบทบาทของพวกมันในการเผาผลาญรีดอกซ์ สายพันธุ์ NADPH-auxotrophic ถูกนํามาใช้ในวิศวกรรมเอนไซม์แบบ grow-coupled โดยอิงจากความจําเพาะของโคแฟกเตอร์ การก่อกลายพันธุ์รอบเดียวโดยใช้ E. coli ให้สารฟอร์เมตดีไฮโดรจีเนสที่ขึ้นกับ NADP+ ที่มีประสิทธิภาพและเฉพาะเจาะจงที่สุดจนถึงปัจจุบัน ขณะที่ P. putida และ C. glutamicum เป็นสายพันธุ์แรกของสายพันธุ์ที่สามารถนํามาใช้ในวิศวกรรมประเภทนี้ได้

กลายพันธุ์ที่ขาดการลด NMN+

มีการพัฒนาระบบคัดเลือกแบบจับคู่การเจริญเติบโตเพื่อเชื่อมโยงวงจรโคแฟกเตอร์กับการเจริญเติบโตที่อิงจากการขาดการลด NMN+ สายพันธุ์ E. coli SHuffle ถูกนํามาใช้ ซึ่งมีการลบในยีนสองตัวที่เกี่ยวข้องกับการผลิตกลูตาไธโอนที่ลดจํานวน มีการพัฒนาเอนไซม์กลูตาไธโอนรีดักเทสที่ขึ้นกับ NMNH ผ่านกระบวนการกลายพันธุ์เชิงเหตุผลเพื่อเชื่อมโยงกระบวนการนี้กับการหมุนเวียน NMN+/NMNH และใช้เอนไซม์กลูโคสดีไฮโดรจีเนสที่ขึ้นกับ NMN+ เพื่อสนับสนุนการหมุนเวียนโคแฟกเตอร์ของ NMN+/NMNH และการเจริญเติบโต การศึกษานี้ยังได้นํา conox cofactor auxotrophy แบบไม่เป็นแคนอนิกัลมาใช้ในวิศวกรรมเอนไซม์แบบ grow-coupled เป็นครั้งแรก ส่งผลให้ได้สารฟอสไฟต์ดีไฮโดรจีเนสที่เสถียรทางความร้อน มีประสิทธิภาพเร่งปฏิกิริยาและเสถียรภาพเชิงเวลาที่ดีขึ้นในหลอดทดลอง งานนี้เป็นสายพันธุ์ที่มีประโยชน์สําหรับวิศวกรรมเอนไซม์แบบ grow-coupled ซึ่งขึ้นอยู่กับการหมุนเวียน NMN+/NMNH และ auxotrophic สําหรับสถานะลดของโคแฟกเตอร์รีดอกซ์ที่ไม่ใช่แคนอนิคัล

ศักยภาพของการเชื่อมโยงการเจริญเติบโตผ่านโคแฟกเตอร์รีดอกซ์เป็นเครื่องมือที่ทรงพลังในการออกแบบตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพ โดยเฉพาะในบริบทของการผลิตชีวภาพอย่างยั่งยืน แม้ว่าจะมีความก้าวหน้าอย่างมากในการสร้างสายพันธุ์ออกโซโทรฟิกของโคแฟกเตอร์รีดอกซ์ แต่คําแถลงนี้ชี้ให้เห็นว่ายังมีแนวทางการวิจัยที่ยังไม่ได้รับการสํารวจอีกหลายทาง หนึ่งในนั้นคือการดัดแปลงสายพันธุ์ cofactor auxotrophic ของสิ่งมีชีวิตอื่นที่ไม่ใช่ E. coli ซึ่งอาจเปิดโอกาสใหม่ ๆ สําหรับวิศวกรรมเอนไซม์ที่เชื่อมโยงการเจริญเติบโต

โดยรวมแล้ว รายงานนี้ชี้ให้เห็นว่าการใช้การเชื่อมโยงการเจริญเติบโตแบบโคแฟกเตอร์รีดอกซ์เป็นโอกาสสําคัญสําหรับวิศวกรรมชีวตัวเร่งปฏิกิริยา โดยเฉพาะสําหรับการผลิตผลิตภัณฑ์ที่ไม่สามารถตอบสนองความต้องการของแนวทางวิศวกรรมเอนไซม์ความเร็วสูงอื่น ๆ ได้ รายงานเน้นย้ําถึงความจําเป็นในการพัฒนาตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพที่หลากหลายและมีประสิทธิภาพมากขึ้นเพื่อการผลิตชีวภาพอย่างยั่งยืน และเน้นย้ําถึงความสําคัญของการวิจัยอย่างต่อเนื่องในด้านนี้


อ้างอิง: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, วิศวกรรมเอนไซม์แบบ grow-coupled ผ่านการจัดการการฟื้นฟูโคแฟกเตอร์รีดอกซ์, Biotechnology Advances, 2023