การวัดปริมาณ NAD+ และสารเมตาโบไลต์ในเส้นประสาทไซอาติกของหนู
บทนํา
ส่วนประกอบสําคัญของนิโคตินาไมด์อะดีนีนไดนิวคลีโอไทด์ (NAD+) และสารเมตาบอไลต์ของมันในกระบวนการชราภาพและการเสื่อมสภาพของระบบประสาทได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวาง เพื่อกระตุ้นความก้าวหน้าในการวิจัยทางชีวเคมีและการแทรกแซงที่มุ่งเป้าไปที่โรคชราและโรคเสื่อมทางระบบประสาท การระบุปริมาณ NAD+ และระดับเมตาบอไลต์ในเส้นทางการกู้คืน NAD+ อย่างแม่นยําจึงมีความสําคัญอย่างยิ่ง ที่นี่ จะใช้วิธี LC-MS/MS ที่แข็งแรงและแม่นยําเพื่อวัดระดับ NAD+ และสารเมตาบอไลต์ในเส้นประสาทไซอาติกของหนูปกติและที่บาดเจ็บข้อจํากัดของวิธีการที่มีอยู่ในการวัดปริมาณ NAD+ และสารเมตาบอไลต์ของมัน
วิธีการแบบดั้งเดิมในการวัดปริมาณ NAD+ และสารเมตาบอไลต์ เช่น HPLC-UV, NMR, อิเล็กโทรโฟรีซิสในโซนแคปิลลารี หรือการทดสอบเอนไซม์เชิงสี เผชิญกับความท้าทายหลายประการในด้านความไว ความเลือกปฏิบัติ และการวัดโดยอ้อม สําหรับการทดสอบ LC-MS/MS ที่มีอยู่สําหรับ NAD+ ของเซลล์หรือเนื้อเยื่อและการวัดเมตาโบไลต์ของมัน ยังมีอุปสรรคอีกมากที่ต้องแก้ไข เช่น ระยะเวลาการทํางานที่ยาวนาน พฤติกรรมการเก็บรักษาโครมาโทกราฟีที่ไม่ดี และรูปร่างสูงสุดที่ไม่น่าพอใจ นอกจากนี้ มีเพียงหนึ่งถึงสามสารในเส้นทางการกู้ภัย NAD+ เท่านั้นที่สามารถครอบคลุมได้ด้วยวิธีเหล่านี้การปรับปรุงวิธี LC-MS/MS
โดยอาศัยการทดสอบ LC-MS/MS ที่มีอยู่ จะมีการปรับปรุงเงื่อนไขโครมาโทกราฟี เมทริกซ์ตัวแทน และเงื่อนไข MS/MS โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กรดเมทิลีนฟอสโฟนิกขนาด 5 ไมโครเมตรถูกใช้เป็นสารเติมแต่งเฟสเคลื่อนที่ ซึ่งช่วยส่งเสริมความเข้มของสัญญาณและรูปร่างสูงสุดอย่างชัดเจน เนื่องจากตัวอย่างที่บริสุทธิ์และเรียบง่าย รวมถึงขนาดเล็ก น้ําบริสุทธิ์สูงจึงถูกทดสอบเป็นเมทริกซ์ทดแทน แทนที่จะใช้คอลัมน์โครมาโตกราฟีของเหลวแบบไฮโดรฟิลิกและคอลัมน์ไฮเปอร์คาร์บ จะใช้คอลัมน์ Waters Atlantis Premier BEH C18 AX ซึ่งมีเทคโนโลยีพื้นผิวประสิทธิภาพสูง MaxPeak HPS ที่เป็นเอกลักษณ์ (การพาสซิเวทผนังด้านในของคอลัมน์ กําจัดพื้นผิวโลหะ) ช่วยให้เกิดการทําซ้ําสูง สมมาตรสูงสุด และการแยกสารวิเคราะห์ทั้งหมดในระดับพื้นฐาน นอกจากนี้ เงื่อนไข MS ยังถูกปรับให้เหมาะสมเพื่อลดสัญญาณรบกวน NAD+ ในช่อง cyclic adenosine diphosphate ribose (cADPR) ในขณะที่ยังคงการตอบสนองของ cADPR และ nicotinamide mononucleotide (NMN) โดยมีแรงดัน 4000V สําหรับแรงดันไอออน, 450°C สําหรับอุณหภูมิเทอร์โบฮีตเตอร์, 50 psi สําหรับก๊าซ 1, 50 psi สําหรับก๊าซ 2, 30 psi สําหรับก๊าซม่าน และ 12 psi สําหรับก๊าซชน
โครมาโทแกรมตัวแทนของตัวอย่างเส้นประสาท (ปกติ vs บาดเจ็บ)
สารวิเคราะห์ทั้งห้าชนิดสามารถแยกตัวได้ตามเกณฑ์พื้นฐาน โดยที่ cADPR เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่ไวต่อการเสื่อมของระบบประสาท ในกรณีนี้ การผ่าตัดเส้นประสาทไซอาติกทําให้เกิดการเสื่อมของเส้นประสาท ส่งผลให้ระดับ NAD+ ลดลงและระดับ NMN ในเส้นประสาทที่บาดเจ็บสูงขึ้น ส่งผลให้อัตราส่วน NMN/NAD+ เพิ่มขึ้นประมาณ 2 เท่า ในเวลาเดียวกัน ระดับนิโคตินาไมด์ (NAM) และอะดีโนซีนไดฟอสเฟตไรโบส (ADPR) ลดลงประมาณ 2 เท่า ขณะที่ระดับ cADPR เพิ่มขึ้นมากกว่า 8 เท่า ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับงานวิจัยที่รายงานก่อนหน้านี้ ซึ่งยืนยันความแม่นยําของวิธี LS-MS/MS ที่ปรับปรุงนี้ในการวัดปริมาณ NAD+ และเมตาบอไลต์ของมัน
บทสรุป
วิธีการ LC-MS/MS ที่ปรับปรุงนี้ช่วยให้สามารถแยก NAD+, NMN, NAM, ADPR และ cADPR ได้อย่างมีประสิทธิภาพภายในเวลาสั้น 5 นาที ซึ่งช่วยให้สามารถวินิจฉัยโรคทางระบบประสาทต่าง ๆ ได้ตั้งแต่เนิ่น ๆ และพัฒนายาสําหรับโรคชราและโรคเสื่อมทางระบบประสาทเอกสารอ้างอิง
Ma Y, Deng L, Du Z. การพัฒนาและตรวจสอบวิธี LC-MS/MS สําหรับการวัดปริมาณ NAD+ และสารเมตาบอไลต์ที่เกี่ยวข้องในเส้นประสาทไซอาติกของหนู และการประยุกต์ใช้กับแบบจําลองสัตว์ที่เกิดการบาดเจ็บของเส้นประสาท J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821บอนแทค นาด
บอนแทคทุ่มเทให้กับการวิจัยและพัฒนา การผลิต และจําหน่ายวัตถุดิบสําหรับโคเอนไซม์และผลิตภัณฑ์ธรรมชาติตั้งแต่ปี 2012 โดยมีโรงงานที่เป็นเจ้าของเอง สิทธิบัตรทั่วโลกกว่า 170 รายการ รวมถึงทีมวิจัยและพัฒนาที่แข็งแกร่ง BONTAC มีประสบการณ์ด้านการวิจัยและพัฒนาอย่างลึกซึ้งและเทคโนโลยีขั้นสูงในการสังเคราะห์NAD และบรรพบุรุษของมัน(เช่น NMN และ NR) มี NAD หลายประเภทให้เลือก ได้แก่ NAD ER เกรด (กําจัดเอนโดซิน), NAD เกรด I (IVD/อาหารเสริม/ผงเครื่องสําอางดิบ), NAD เกรด II (API/สารมีชีวิตชีวา) และ NAD เกรด IV (ถ้ามีความต้องการความละลายสูงกว่า) ซึ่งสามารถจัดให้ในรูปแบบผงไลโอฟิไลซ์หรือผงผลึก ความบริสุทธิ์ของ BONTAC NAD สามารถสูงกว่า 98%
