การวัดปริมาณ NAD+ และเมแทบอไลต์ในเส้นประสาทไซแอติกของหนู
บทนำ
บทบาทสำคัญของนิโคตินาไมด์อะดีนีนไดนิวคลีโอไทด์ (NAD+) และเมแทบอไลต์ของมันในความชราและโรคความเสื่อมของระบบประสาทได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวาง เพื่อกระตุ้นความก้าวหน้าในการวิจัยทางชีวเคมีและการแทรกแซงที่มุ่งเป้าไปที่ความชราและโรคความเสื่อมของระบบประสาท การวัดปริมาณ NAD+ และระดับเมแทบอไลต์ในวิถีการกอบกู้ NAD+ อย่างแม่นยำจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง ในที่นี้ ใช้วิธี LC-MS/MS ที่แข็งแกร่งและแม่นยำเพื่อวัดปริมาณ NAD+ และระดับเมแทบอไลต์ของมันในเส้นประสาทไซแอติกของหนูเมาส์ปกติและที่ได้รับบาดเจ็บข้อจำกัดของวิธีการที่มีอยู่สำหรับการวัดปริมาณ NAD+ และเมแทบอไลต์ของมัน
วิธีการดั้งเดิมสำหรับการวัดปริมาณ NAD+ และเมแทบอไลต์ เช่น HPLC-UV, NMR, capillary zone electrophoresis หรือ colorimetric enzymatic assays เผชิญกับความท้าทายต่างๆ ในด้านความไว ความจำเพาะ และการวัดโดยอ้อม สำหรับการตรวจวัด LC-MS/MS ที่มีอยู่สำหรับการวัด NAD+ และเมแทบอไลต์ในเซลล์หรือเนื้อเยื่อ ยังคงมีความยากลำบากมากมายที่ต้องเอาชนะ เช่น เวลาการทำงานที่ยาวนาน พฤติกรรมการกักเก็บโครมาโตกราฟีที่ไม่ดี และรูปร่างพีคที่ไม่น่าพอใจ ยิ่งไปกว่านั้น วิธีการเหล่านี้ครอบคลุมได้เพียงหนึ่งถึงสามสารในวิถีการกอบกู้ NAD+ เท่านั้นการปรับเปลี่ยนวิธี LC-MS/MS
บนพื้นฐานของการตรวจวัด LC-MS/MS ที่มีอยู่ ได้ดำเนินการปรับเปลี่ยนเกี่ยวกับสภาวะโครมาโตกราฟี เมทริกซ์ทดแทน และสภาวะ MS/MS โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ใช้กรดเมทิลีนฟอสโฟนิก 5 ไมโครโมลาร์เป็นสารเติมแต่งเฟสเคลื่อนที่ ซึ่งส่งเสริมความเข้มของสัญญาณและรูปร่างพีคอย่างชัดเจน เนื่องจากตัวอย่างเส้นประสาทมีความสะอาดและเรียบง่ายค่อนข้างมากและมีขนาดเล็ก จึงทดสอบน้ำบริสุทธิ์พิเศษเป็นเมทริกซ์ทดแทน แทนที่จะใช้คอลัมน์ hydrophilic interaction liquid chromatography และคอลัมน์ hypercarb กลับใช้คอลัมน์ Waters Atlantis Premier BEH C18 AX ซึ่งเทคโนโลยีพื้นผิวประสิทธิภาพสูง MaxPeak HPS ที่เป็นเอกลักษณ์ (การทำให้ผนังด้านในคอลัมน์เป็นพาสซีฟ กำจัดพื้นผิวโลหะ) ช่วยให้มีความสามารถในการทำซ้ำสูง ความสมมาตรของพีค และการแยกสารวิเคราะห์ทั้งหมดที่เส้นฐานนอกจากนี้ ยังปรับสภาวะ MS ให้เหมาะสมเพื่อลดสัญญาณรบกวน NAD+ ในช่อง cyclic adenosine diphosphate ribose (cADPR) ในขณะที่รักษาการตอบสนองของ cADPR และ nicotinamide mononucleotide (NMN) โดยใช้แรงดันไอออนสเปรย์ 4000V อุณหภูมิเทอร์โบฮีตเตอร์ 450℃ แก๊ส 1 ที่ 50 psi แก๊ส 2 ที่ 50 psi แก๊สกั้นที่ 30 psi และแก๊สชนที่ 12 psi
โครมาโตแกรมตัวแทนของตัวอย่างเส้นประสาท (ปกติเทียบกับได้รับบาดเจ็บ)
สารวิเคราะห์ทั้งห้าชนิดแยกที่เส้นฐานได้ โดยที่ cADPR เป็นไบโอมาร์กเกอร์ที่ไวในแบบจำลองโรคความเสื่อมของระบบประสาท ในที่นี้ การตัดเส้นประสาทไซแอติกทำให้เกิดการเสื่อมของแอกซอน นำไปสู่ระดับ NAD+ ที่ลดลงและระดับ NMN ที่สูงขึ้นในเส้นประสาทที่ได้รับบาดเจ็บ ส่งผลให้อัตราส่วน NMN/NAD+ เพิ่มขึ้นประมาณ 2 เท่า ในเวลาเดียวกัน ระดับของ nicotinamide (NAM) และ adenosine diphosphate ribose (ADPR) ลดลงประมาณ 2 เท่า ในขณะที่ระดับ cADPR เพิ่มขึ้นมากกว่า 8 เท่า ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับผลการวิจัยที่รายงานก่อนหน้านี้ ซึ่งยืนยันความแม่นยำของวิธี LS-MS/MS ที่ปรับเปลี่ยนนี้ในการวัดปริมาณ NAD+ และเมแทบอไลต์ของมัน
บทสรุป
วิธี LC-MS/MS ที่ปรับเปลี่ยนนี้ช่วยให้สามารถแยก NAD+, NMN, NAM, ADPR และ cADPR ที่เส้นฐานได้อย่างมีประสิทธิภาพภายในเวลาทำงานสั้นเพียง 5 นาที ซึ่งมีส่วนช่วยในการวินิจฉัยโรคทางระบบประสาทต่างๆ ในระยะเริ่มต้นและการพัฒนายาสำหรับความชราและโรคความเสื่อมของระบบประสาทเอกสารอ้างอิง
Ma Y, Deng L, Du Z. การพัฒนาและการตรวจสอบความถูกต้องของวิธี LC-MS/MS สำหรับการวัดปริมาณ NAD+ และเมแทบอไลต์ที่เกี่ยวข้องในเส้นประสาทไซแอติกของหนูเมาส์และการประยุกต์ใช้กับแบบจำลองสัตว์ที่ได้รับบาดเจ็บทางเส้นประสาท J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACทุ่มเทให้กับการวิจัยและพัฒนา การผลิต และการขายวัตถุดิบสำหรับโคเอ็นไซม์และผลิตภัณฑ์ธรรมชาติมาตั้งแต่ปี 2012 โดยมีโรงงานเป็นของตนเอง สิทธิบัตรทั่วโลกมากกว่า 170 รายการ และทีมวิจัยและพัฒนาที่แข็งแกร่ง BONTAC มีประสบการณ์ด้านการวิจัยและพัฒนาที่หลากหลายและเทคโนโลยีขั้นสูงในการสังเคราะห์ทางชีวภาพของNAD และสารตั้งต้นของมัน(เช่น NMN และ NR) มี NAD หลายประเภทให้เลือก ครอบคลุม NAD เกรด ER (การกำจัดเอนโดทอกซิน), NAD เกรด I (ผงวัตถุดิบสำหรับ IVD/อาหารเสริม/เครื่องสำอาง), NAD เกรด II (API/ตัวกลาง) และ NAD เกรด IV (หากมีความต้องการสูงขึ้นเกี่ยวกับความสามารถในการละลาย) ซึ่งสามารถจัดหาได้ในรูปแบบผงแห้งเยือกแข็งหรือผงผลึก ความบริสุทธิ์ของ NAD ของ BONTAC สามารถสูงถึงมากกว่า 98%
